М╡Н╡СТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРА╞НИ
Н А К А З
N 321 вiд 21.08.2002
м. Ки©в
Про затвердження iнструкцi© з лабораторно© дiагностики сибiрки у людей,
в сировинi тваринного походження та об'╨ктах довкiлля Щороку в Укра©нi
вiд людей та з об'╨ктiв довкiлля видiляються культури сибiрки. Тiльки
за останнi три роки вiд людей було видiлено 14, а з об'╨ктiв довкiлля 9
штамiв Bacillus anthracis. Обсяг лабораторних дослiджень на сибiрку в 2001
роцi зрiс у порiвняннi з минулими роками майже на 20%. Збiльшення обсягу
дослiджень, в першу чергу з об'╨ктiв довкiлля, пов'язано з терористичними
актами використання збудника сибiрки i випадками зараження ним людей в деяких
кра©нах свiту та з метою попередження виникнення надзвичайних ситуацiй в
нашiй кра©нi. Проби "невiдомих речовин" дослiджувались у всiх областях,
окрiм Ки©всько©. Найбiльше цих дослiджень проведено в Донецькiй,
Днiпропетровськiй, Херсонськiй, Волинськiй, Полтавськiй, Черкаськiй,
Кiровоградськiй областях, мiстах Ки╨вi та Севастополi. Надзвичайна ситуацiя
2001 року ще раз пiдтвердила необхiднiсть постiйно© готовностi до проведення
лабораторних дослiджень на особливо небезпечнi iнфекцi©, в т.ч. сибiрки.
З метою удосконалення лабораторно© дiагностики сибiрки Н А К А З У Ю:
1.Затвердити Iнструкцiю з лабораторно© дiагностики сибiрки у людей, в сировинi
тваринного походження та об'╨ктах довкiлля (дода╨ться).
2. Мiнiстру охорони здоров'я Автономно© Республiки Крим, начальникам управлiнь
охорони здоров'я обласних, Севастопольсько© мiсько© державних адмiнiстрацiй,
Головногоуправлiння охорони здоров'я Ки©всько© мiсько© державно© адмiнiстрацi©,
головним державним санiтарним лiкарям Автономно© Республiки Крим, областей,
мiст Ки╨ва та Севастополя, головному лiкарю Центрально© санепiдстанцi© МОЗ
Укра©ни, директору Укра©нського науково-дослiдного протичумного iнституту,
начальнику Кримсько© протичумно© станцi©:
2.1. Забезпечити сво╨часнудiагностику сибiрки в осiб, з пiдозрою на це захворювання,
в сировинi тваринного походження та об'╨ктах довкiлля вiдповiдно до Iнструкцi©.
2.2. Вжити заходiв щодо забезпечення постiйно© готовностi установ до проведення
таких дослiджень.
3. Головним державним санiтарним лiкарям Автономно©
Республiки Крим, областей, мiст Ки╨ва i Севастополя:
3.1. Забезпечити
лабораторi© вiддiлiв особливо небезпечних iнфекцiй необхiдними дiагностичними
поживними середовищами, iмунобiологiчними препаратами, реактивами,
антибiотиками та лабораторними тваринами.
3.2. Встановити жорсткий контроль
за виконанням вимог протиепiдемiчного режиму в пiдроздiлах, де проводиться
робота з матерiалом, пiдозрiлим на контамiнацiю збудником сибiрки, та надiйну
систему охорони ©х.
3.3. Направляти видiленi штами збудника сибiрки для
iдентифiкацi© та подальшого вивчення до лабораторi© особливо небезпечних
iнфекцiй Центрально© санiтарно-епiдемiологiчно© станцi© МОЗ Укра©ни - референс
лабораторi© з дiагностики зооантропонозних iнфекцiй.
4. Центральнiй
санiтарно-епiдемiологiчнiй станцi© МОЗ Укра©ни (Некрасова Л.С.)
4.1.Надавати установам та закладам охорони здоров'я, державно© санiтарно-
епiдемiологiчно© служби органiзацiйно-методичну i практичну допомогу з
питань лабораторно© дiагностики сибiрки.
4.2. Забезпечити iдентифiкацiю та вивчення штамiв збудника сибiрки, видiлених
вiд хворих та з об'╨ктiв довкiлля.
5. Вважати такими, що втратили чиннiсть "Методические указания по
лабораторной диагностике сибирской язвы у животных и людей и обнаружению
возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения в объектах внешней
среды", Москва, 1986.
6. Контроль за виконанням наказу покласти на начальника
Головного санепiдуправлiння МОЗ Укра©ни Бережного С.П. Перший заступник
Державного секретаря, Головний державний санiтарний лiкар Укра©ни О.О.
Бобильова ЗАТВЕРДЖЕНО Наказ Мiнiстерства охорони здоров'я
Укра©ни 21.08.2002 N 321 IНСТРУКЦIЯ З ЛАБОРАТОРНО╞ ДIАГНОСТИКИ СИБIРКИ
У ЛЮДЕЙ, В СИРОВИНI ТВАРИННОГО ПОХОДЖЕННЯ ТА ОБ'╙КТАХ ДОВКIЛЛЯ
1. Загальнi положення Лабораторнi дослiдження на сибiрку вiд людей та з
об'╨ктiв довкiлля здiйснюються на базi лабораторiй вiддiлiв особливо
небезпечних iнфекцiй санепiдстанцiй, в протичумних установах, якi мають
дозвiл на роботу iз збудниками II групи патогенностi. Дослiдження на
сибiрку включа╨ мiкроскопiю мазкiв з дослiджуваного матерiалу, посiви
на поживнi середовища, постановку бiопроби, при необхiдностi, реакцiю
преципiтацi©, iдентифiкацiю видiлених культур. Збудник сибiрки - Вас.
anthracis, вiдноситься до роду Bacillus, сiмейства Bacillacea, - нерухома
велика грампозитивна паличка, довжиною 5-10 мк, товщиною 1-1,5 мк, оптимум
росту 35-37 град. С, рН 7,2-7,6. При культивуваннi на поживних середовищах,
а також в трупному матерiалi утворю╨ спори. Спори ово©дно© форми, мiстяться
в центрi мiкробно© клiтини, не перевищуючи ©© поперечника. В органiзмi
людини, сприйнятливих тварин, свiжих трупах та кровi загиблих тварин, а
також на поживних середовищах з додаванням сироватки або кровi утворю╨
капсулу. Здатнiсть утворювати капсулу i специфiчний екзотоксин обумовлю╨
патогеннiсть збудника. Збудник сибiрки невибагливий до поживних середовищ,
да╨ пишний рiст на МПБ i МПА. В бульйонi рiст у виглядi крупних пластiвцiв,
якi через добу осiдають на дно пробiрки нагадуючи "жмуток вати". На агарi
рiст бацил сибiрки можна помiтити пiд малим збiльшенням мiкроскопа вже
через 4 години пiсля вирощування в термостатi. Через 18-20 годин з'являються
добре розвиненi колонi© збудника сибiрки - великi, шорсткi, матовi,
бiлувато-сiрi, по зовнiшньому виду нагадують пухкий таючий снiг. Типовим
для молодих колонiй сибiрки ╨ наявнiсть тонких вiдросткiв - "вусикiв".
Пiд малим збiльшенням мiкроскопа (у 10-60 разiв) колонi© мають вид локонiв,
що складаються зi сплетень довгих ниток мiкробiв i отримали назву "голови
медузи", "левово© гриви". Збудник сибiрки може розкладати з утворюванням
кислоти без газу глюкозу, мальтозу, сахарозу. При посiвi на молоко воно
зсiда╨ться повiльно, через 2-4 доби i надалi також повiльно пептонiзу╨ться.
Лакмусове молоко червонi╨ за рахунок утворення кислоти. У збудника сибiрки
встановлена наявнiсть каталази i лецитiнази, нема╨ уреазно© та фосфотазно©
активностi, вiн чутливий до пенiцилiну, лiзу╨ться специфiчними бактерiофагами,
патогенний для лабораторних тварин.
2. ЛАБОРАТОРНА ДIАГНОСТИКА СИБIРКИ У ЛЮДЕЙ
2.1. Вiдбiр i пересилка матерiалу на дослiдження Матерiал забирають:
-вiд хворого
- медичний персонал лiкувально-профiлактичних закладiв, негайно
пiсля виявлення i до початку лiкування антибiотиками;
- при обстеженнi вогнищ - помiчники епiдемiологiв;
- трупний матерiал - патологоанатоми i судмедексперти в спецiалiзованих закладах. При шкiрнiй формi захворювання
дослiдженню пiдляга╨ вмiст везикул, карбункулiв, виразка або вiдторгнутий
струп. Перед вiдбором матерiалу у хворого (бажано до початку лiкування)
шкiра навколо ураженого мiсця i поверхня карбункула обережно протираються
спиртом. При пiдозрi на легеневу форму сибiрки дослiджу╨ться мокрота, на
кишкову форму - випорожнення хворого або сеча (1-2 л). У випадках септично©
форми захворювання беруть кров iз вени, бажано в перiод гарячки. Кров в
кiлькостi 1-2 мл засiвають на рiдкi та 1-2 краплi на щiльнi поживнi
середовища, а також роблять два тонких мазки на предметних скельцях.
У померлих беруть частини уражених органiв, тканин, кров, селезiнку у
встановленому порядку щодо проведення патолого-анатомiчних та
серцево-медичних експертних дослiджень.
2.2. Направлення матерiалу на дослiдження Патологiчний матерiал, що пiдляга╨ дослiдженню, вмiщують у
стерильний посуд (пробiрки, банки). Висушенi мазки вмiщують у чашки Петрi,
якi обгортають щiльним папером. На упаковцi роблять напис "Мазок не фiксований!".
Посуд iз патологiчним матерiалом вмiщують у вологонепроникливу тару,
обв'язують, пломбують або опечатують, роблять надпис "Верх, обережно"
i направляють в лабораторiю спецiальним посильним. На супровiднiй етикетцi
до матерiалу вказують прiзвище, iм'я, по батьковi хворого (померлого), дата
захворювання, мiсце i час забору матерiалу, його назву i можливий дiагноз.
2.3. Порядок проведення дослiдження Лабораторне дослiдження матерiалу включа╨:
- мiкроскопiчне дослiдження (перегляд мазкiв i IФМ); - бактерiологiчне
дослiдження (посiви на поживнi середовища, видiлення чисто© культури);
- бiологiчне дослiдження (на лабораторних тваринах);
- серологiчне дослiдження (реакцiя преципiтацi© i РПГА);
- iдентифiкацiю видiлених культур. У випадку доставки матерiалу, що загнив,
його дослiджують тiльки в реакцi© преципiтацi©.
2.4. Мiкроскопiчне (попередн╨) дослiдження
2.4.1. З доставленого матерiалу
роблять мазки, фiксують етиловим спиртом з добавленням 3% перекису водню
(додаток п.1), фарбують по Граму i на капсулу по Ребiгеру, Мiхiну,
Ольту або Романовському-Гимзi; а також обробляють люмiнесцентними
сироватками - по методу флуоресцуючих антитiл.
2.4.2. В мазках, пофарбованих по Граму, Вас. anthracis - прямi грампозитивнi
палички, якi розташовуються короткими ланцюжками або попарно, кiнцi ©х зверненi один до одного, рiзко
обрубанi, вiльнi кiнцi закругленi. В окремих випадках форма збудникiв сибiрки
може бути нехарактерною (короткi товстi або зiгнутi, iнодi зернистi палички
зi здуттям посерединi або на кiнцi, можлива наявнiсть "тiней" мiкробiв).
В мазках iз свiжого патологiчного матерiалу, пофарбованих спецiальними
методами, палички сибiрки оточенi капсулою. Iснують штами сибiрки, якi
не утворюють капсулу i ╨ авiрулентними. Видiлення та iдентифiкацiя таких
культур наведена в додатку до лабораторно© дiагностики. При фарбуваннi
мазкiв iз несвiжого патологiчного матерiалу мiкроби можуть бути трохи
збiльшенi, кiнцi закругленi, морфологiчна структура бацил порушена, вони наче
по©денi, iнодi залишаються "тiнi", а вiд капсул можуть залишатися обривки,
якi дуже слабо забарвлюються.
2.4.3. Обробку препаратiв люмiнесцентними
сироватками проводять вiдповiдно до настанови по ©х застосуванню. Виявлення в
мазку специфiчного свiчiння дозволя╨ пiдозрювати наявнiсть у дослiджуванiй
пробi збудника сибiрки.
2.4.4. За результатами мiкроскопiчного дослiдження
негайно вида╨ться попередня вiдповiдь.
2.5. Бактерiологiчне дослiдження (посiви на поживнi середовища)
2.5.1. Посiви з дослiджуваного матерiалу проводять на диференцiйно-дiагностичне
середовище з 0,01% фенолфтале©нфосфату натрiю або м'ясо-пептонний агар (МПА),
м'ясо-пептонний бульйон (МПБ), або бульйон i агар Хотiнгера (рН 7,4 +- 0,2).
Посiви iнкубують 18-24 год. при температурi 37 +-1 град. С, а при вiдсутностi
росту, витримують при цiй же температурi ще 48 год. З свiжого патологiчного
матерiалу можна одночасно робити висiви на систему диск-преципiтацi©
(додаток 2). Посiв проводять пастерiвською пiпеткою в МПБ, що знаходиться
над шаром агарового гелю. Не слiд вносити в середовище багато кровi або
великi шматочки кровонаповнених органiв, тому що це затрудню╨ виявлення
специфiчного диску преципiтацi© внаслiдок фарбування гелю. Постановка та
облiк диск-преципiтацi© в п. 3.5. 2.5.2. На щiльних поживних середовищах
збудник сибiрки утворю╨ плоскi матово-сiрi шорсткуватi (R-форма) колонi©.
Центр колонiй iнодi затемнений, периферiя торочкувата з локоноподiбними
паростками. Зустрiчаються колонi© з менш вираженою шорсткiстю i без паросткiв,
вони також пiдлягають подальшiй iдентифiкацi©. Пiд малим збiльшенням
мiкроскопа колонi© мають вид локонiв. Культури, що виросли на
диференцiйно-дiагностичному середовищi обробляють парами амiаку i для
подальшого дослiдження вiдбирають тiльки безбарвнi колонi©. МПБ пiсля
добового росту збудникiв сибiрки залиша╨ться прозорим, на днi утворю╨ться
пухкий осад у виглядi жмутка вати. При струшуваннi пробiрки бульйон не мутнi╨,
осад розбива╨ться на дрiбнi пластiвцi. В окремих випадках у МПБ може бути
дифузний рiст культури (легке помутнiння), при струшуваннi утворюються
муаровi хвилi. 2.5.3. З бульйонно© культури роблять мазки, фарбують по
Граму i дослiджують пiд мiкроскопом. У мазках з типово© бульйонно© культури
збудника сибiрки палички виявляються у виглядi ланцюжкiв, iз бульйонно©
культури з дифузним ростом - окремi або парно розташованi палички.
2.5.4. При одержаннi змiшано© культури, видiлення чисто© культури збудника
сибiрки проводять звичайними методами (дрiбний розсiв на щiльнi поживнi
середовища в чашки Петрi, вiдсiв окремих колонiй, зараження бiлих мишей).
2.5.5. З шорсткуватих колонiй, що виросли на МПА, а також iз безбарвних
колонiй на диференцiйно-дiагностичному середовищi роблять мазки, пересiвають
у МПБ i на МПА для подальшо© ©х iдентифiкацi©. При вiдсутностi росту посiви
витримують 5 дiб. Дослiджуванi культури замiсть МПБ можна пересiвати в
систему для постановки реакцi© диск-преципiтацi©. У цьому випадку подальшу
роботу проводять тiльки з культурами, що дали позитивнi або нечiткi результати.
2.6. Бiологiчне дослiдження
2.6.1. Зараження лабораторних тварин дослiджуваним
матерiалом ╨ обов'язковим i проводиться в день надходження матерiалу одночасно
з посiвом на поживнi середовища. Дослiджуваний матерiал, розтертий у
невеликому об'╨мi 0,9%-ного розчину натрiю хлориду, вводять двом бiлим мишам
у дозi 0,2-0,5 мл пiд шкiру спини ближче до кореня хвоста або двом морським
свинкам у дозi 0,5-1,0 мл пiдшкiрно в областi внутрiшньо© поверхнi стегна.
При дослiдженнi кровi ("чистого" матерiалу) використову╨ться внурiшньочеревне
зараження. Загибель заражених бiлих мишей наступа╨ через 1-2 доби з
появленням набряку i загального сепсису, морськi свинки через 2-3 доби з
тими ж проявами. Iнодi загибель вiдбува╨ться пiзнiше. 2.6.2. Тварин, якi
загинули, розтинають, роблять мазки i посiви з кровi серця, селезiнки,
печiнки, iнфiльтрату на мiсцi iн'╨кцi© дослiджуваного матерiалу.
В мазках з кровi, серця, селезiнки бактерiоскопiчно встановлюють наявнiсть
збудникiв сибiрки у виглядi коротких ланцюжкiв, паличок, оточених капсулою.
Посiви з органiв та кровi дають на МПА колонi© R-форми, а на бульйонi - рiст
iз утворенням пластiвцiв на днi пробiрки (жмуток вати). При розтинi
лабораторних тварин, що загинули вiд сибiрки, виявля╨ться типова
патолого-анатомiчна картина. При пiдшкiрному зараженнi - рiзкий драглеподiбний
набряк пiдшкiрно© клiтчатки, ексудат в черевнiй та груднiй порожнинах,
багаточисельнi геморагi©, збiльшення лiмфатичних вузлiв. Печiнка та селезiнка
збiльшенi, кров, як правило, не згорта╨ться. В легенях - пневмонiчнi дiлянки.
У випадках дуже швидко© смертi тварин, патолога-анатомiчнi змiни, особливо
набряк, не встигають розвинутись i вираженi не так рiзко. Необхiдно
враховувати, що при дослiдженнi матерiалу (особливо матерiалу вiд тварин)
лабораторнi тварини можуть загинути вiд супутньо© патогенно© мiкрофлори,
частiше вiд пастерел. У цих випадках проводять повторне зараження лабораторних
тварин видiленими пiдозрiлими на збудник сибiрки культурами.
2.6.3. У випадках, коли чиста культура збудника з посiвiв матерiалу на
поживному середовищi отримана ранiше, нiж наступить смерть заражених тварин,
додатково заражають добовою бульйонною культурою двох лабораторних тварин в
дозах, зазначених вище.
2.6.4. Спостереження за лабораторними тваринами,
зараженими патологiчним матерiалом або культурою, ведуть протягом 10 дiб.
Розтин тварин проводять тiльки в разi ©х загибелi.
2.7. Серологiчнi дослiдження
2.7.1. Реакцiя преципiтацi©. Ця реакцiя не застосову╨ться для прижитт╨вого
дiагнозу. Перед постановкою реакцi© свiжий патологiчний матерiал витримують
у термостатi протягом 18-20 год. Несвiжий патологiчний матерiал екстрагують
без витримування в термостатi. Екстрагування проводять двома способами:
гарячим i холодним. При цьому потрiбно враховувати, що екстракти, отриманi
гарячим способом, бiднiшi преципiтиногенами. Гарячий спосiб екстрагування:
шматочки дослiджуваного патологiчного матерiалу (1-2 г) вмiщують в пробiрку
або колбу, заливають 0,9%-ним розчином натрiю хлориду в спiввiдношеннi 1:10
i кип'ятять протягом 30-40 хв. на водянiй банi. Холодний спосiб екстрагування
: шматочки патологiчного матерiалу (1-2 г) розтирають в ступцi з пiском,
переносять в колбу або баночку, заливають 0,9%-ним розчином натрiю хлориду
(з додаванням 0,3% кристалiчного фенолу) в спiввiдношеннi 1:10 i залишають
на 16-18 год. при температурi (20 +- 2) град. С. Отриманi екстракти фiльтрують
через азбестову вату або фiльтрувальний папiр до прозоростi, першi краплi
фiльтрату видаляють. Реакцiю ставлять шляхом нашаровування або пiдшаровування
. При нашаровуваннi в уленгутiвську пробiрку наливають 0,2 - 0,3 мл прозоро©
преципiтуючо© сибiрково© сироватки i обережно нашаровують рiвну кiлькiсть
екстракту так, щоб мiж компонентами була чiтко виражена межа (тонка пряма
лiнiя). При пiдшаровуваннi в уленгутiвську пробiрку спочатку вносять 0,2-0,3
мл екстракту, потiм пiд нього обережно пастерiвською пiпеткою пiдшаровують
рiвну кiлькiсть преципiтуючо© сироватки. Якщо при з'╨днаннi компонентiв чiтко
виражена межа мiж ними вiдсутня, реакцiю ставлять повторно. Одночасно ставлять
контроль преципiтуючо© сибiрково© сироватки з стандартним сибiрковим
антигеном. Через 1-2 хв. пiсля з'╨днання компонентiв, з'явля╨ться характерн
е кiльце (реакцiя позитивна) та негативний контроль сироватки з неспецифiчним
антигеном. Реакцiю вважають позитивною, якщо через 1-2 хв. i не пiзнiше, нiж
через 15 хв. на межi мiж компонентами з'явиться тонке бiлувате кiльце.
При негативному результатi реакцi© преципiтацi© з екстрактом, отриманим
гарячим способом, реакцiю ставлять повторно з екстрактом, отриманим холодним
способом. Е.Шляхов, С.Шварц та iн. запропонували для дiагностики сибiрки
використовувати дифузну преципiтацiю в агаровому гелi з екстрактом iз струпа
карбункула (1964). Агар, що використову╨ться для реакцi© преципiтацi©,
розливають в чашки Петрi. По охолодженнi в ньому вирiзають два ряди лунок,
дно яких заливають тонким шаром того ж агару. Вiдстань мiж лунками - 6 мм.
В один ряд лунок наливають по 0,2 мл сибiрково© сироватки, в другий - екстракт
струпа - цiльний i розведений в 2-4-8-16 разiв в тому ж об'╨мi. Для контролю в
одну з лунок другого ряду вносять сибiрковий антиген. Чашки витримують при
кiмнатнiй температурi протягом 48 годин. При позитивному результатi мiж
лунками з сироваткою i екстрактом iз струпа з'явля╨ться лiнiя преципiтацi©,
що вiдповiдна до лiнi© в контролi. При дослiдженнi струпа реакцiя специфiчна.
2.7.3. Реакцiя непрямо© (пасивно©) гемаглютинацi© (РНГА) Реакцiя використову╨ться
для виявлення та iдентифiкацi© спорових та вегетативних форм збудника сибiрки
в пiдозрiлих культурах, об'╨ктах довкiлля та матерiалi вiд хворих людей i
тварин. Постановка та облiк результатiв проводиться вiдповiдно до настанови
по застосуванню еритроцитарного дiагостикума. 2.8. Iдентифiкацiя збудника
сибiрки 2.8.1. Iдентифiкацiю збудника сибiрки проводять за такими ознаками:
- морфологiя мiкроба, включаючи наявнiсть капсул в мазках iз дослiджуваного
матерiалу або органiв загиблих лабораторних тварин; культуральнi властивостi;
чутливiсть до пенiцилiну;
* чутливiсть до специфiчних фагiв; патогеннiсть для
лабораторних тварин _______________
* На територi© Укра©ни мають мiсце випадки видiлення штамiв, нечутливих до пенiцилiну
2.8.2. Чутливiсть до пенiцилiну (тест "перлинового намиста")
Агар, що мiстить 0,5 i 0,05 одиниць (од.) пенiцилiну в 1 мл середовища
(додаток 5), i без нього, розливають у чашки Петрi; пiсля застигання пробiркою
з рiвними краями надсiкають агар або вирiзують пластинки (1,5 х 1,5 см),
якi переносять на предметнi скельця i вмiщують у чашки Петрi. На кожну пластинку
бактерiологiчною петлею наносять 3-годинну бульйонну культуру. Чашки закривають
кришками i вмiщують у термостат. Через 1-3 год. посiви переглядають пiд мiкроскопом
з сухою (об'╨ктив х 40) i iмерсiйною системами. Перед переглядом зону росту
накривають покривним склом. Мiкроби сибiрки на МПА з пенiцилiном приймають
кулькоподiбнi форми, а ланцюжки мають вигляд "перлинового намиста".
Спороутворюючi сапрофiтнi аеробнi мiкроби в аналогiчних умовах виростають
у виглядi звичайних форм. На агарi без пенiцилiну збудник сибiрки утворю╨
довгi ланцюжки, що складаються з типових паличок. При негативному результатi
мiкроскопi© iнкубацiю посiвiв продовжують до 6 год., пiсля чого дослiджують
повторно i роблять заключний облiк тесту. Модифiкацiя тесту "перлинового
намиста" з використанням 0,3% агару Хотiнгера (Н.П.Буравцева, В.О.Ярощук)
До розплавленого i охолодженого до 43 град. С 0,3% агару Хотiнгера рН (7,3-7,6)
додають 20-40% iнактивовано© при 56 град. С кiнсько© сироватки. Виготовлене
середовище стерильно розливають по 4,5 мл в пробiрки i засiвають по 0,1 мл
суспензi© спорово© або вегетативно© форми культури сибiрки, що мiстить вiд
100 тис. мiкробних клiтин по стандарту мутностi. Пробiрки з посiвами
iнкубують на протязi 4 годин при 37 град. С, потiм додають пенiцилiн iз
розрахунку 0,5-0,05 од. на 1 мл середовища. Пробiрки ставлять в термостат
при 37 град. С на пiдрощування на 1,5-2 години, пiсля чого роблять мазки,
висушують на повiтрi i фiксують в етиловому 96 % спиртi з доданням 3%
перекису водню на протязi 30 хвилин. Пiсля фiксацi© мазки висушують на
повiтрi, фарбують метиленовою синькою або люмiнесцентними сироватками i
мiкроскопують. Модифiкацiя тесту "перлинового намиста" з використанням МПБ.
Використову╨ться МПБ з додаванням 20% iнактивовано© кiнсько© сироватки.
На 100 мл МПБ вноситься 0,5 мл розчину, що вмiщу╨ 100 од. пенiцилiну в 1 мл
(отриму╨мо в 1 мл МПБ 0,5 од. пенiцилiну). Для отримання в 1 мл МПБ 0,05 од
. пенiцилiну в 100 мл МПБ вносять 0,5 мл пенiцилiну, що мiстить 10 од/мл.
В 3 мл МПБ з iнактивованою кiнською сироваткою та розчинами пенiцилiну
(0,5 та 0,05 од/мл) дода╨ться по 2-3 краплi 3-годинно© або добово© бульйонно©
культури i iнкубу╨ться напротязi 3 годин при температурi 37 град. С. Готують
мазки, матерiал беруть з дна пробiрки, мазки фiксують рiдиною Карнуа
(6 частин етилового спирту, 3 частини хлороформу, 1 частина крижано© оцтово©
кислоти) до ©© випарювання, фарбують метиленовою синькою 20-30 секунд i
мiкроскопують. Bacillus anthracis знаходиться в мазках у виглядi
куликоподiбних форм. B. Cereus та iншi сапрофiтнi бацили на середовищi
з пенiцилiном ростуть звичайно. У випадку негативного результату iнкубацiю
посiвiв слiд продовжити до 6 годин.
2.8.3. Чутливiсть до специфiчних фагiв Чутливiсть до фагiв визначають одним
з таких методiв: стiкаючо© краплi, пробiрочним або мiкрометодом з
використанням сибiркового бактерiофагу К, ВIЕВ у вiдповiдностi з настановами
по застосуванню. Для тесту фаготипування використовують збудник сибiрки
тiльки у вегетативнiй формi.
2.8.4. Патогеннiсть для лабораторних тварин Патогеннiсть пiдтверджу╨ться
смертю хоча б однi╨© з двох лабораторних тварин, заражених дослiджуваним
матерiалом або отриманою культурою, з подальшим видiленням з його органiв
типово© культури збудника сибiрки.
2.8.5. Додатковi тести iдентифiкацi©. Вiдсутнiсть гемолiзу визнача╨ться
при посiвi дослiджувано© культури на МПА з 5-10% дефiбрiновано© кровi барана.
Посiви iнкубують при 37 град. С на протязi 18-20 годин i проводять облiк.
Вiдсутнiсть лецитiназно© активностi визнача╨ться при посiвi дослiджувано©
культури на рiдке я╨чне середовище. Середовище виготовляють шляхом змiшування
однi╨© частини курячого жовтка, що стерильно забира╨ться, з двома частинами
стерильного 0,85% розчину хлориду натрiю. Середовище розливають в пробiрки,
засiвають петлею дослiджувану культуру i iнкубують при 37 град. С. Збудник
сибiрки, як правило, жовток не згорта╨ на протязi декiлькох дiб iнкубацi©.
Вiдсутнiсть фосфотазно© активностi визнача╨ться на такому середовищi.
До розплавленого i охолодженого до 45 град. С МПА додають 0.001%
фенолфтале©нфосфату натрiю. Середовище розлива╨ться в чашки Петрi i,
пiсля пiдсушування, на поверхню штрихом засiва╨ться дослiджувана культура.
Через 18-24 години на поверхню агару дода╨ться декiлька краплин нашатирного
спирту. Колонi© сибiрки, що не утворюють фосфотази, залишаються безбарвними,
а колонi© спороутворюючих сапрофiтiв забарвлюються вiд рожевого до червоного
кольору. 2.8.6. Видiлену культуру вiдносять до Вас. anthracis: - при
наявностi характерних морфологiчних i культуральних властивостей, капсул у
мазках iз патологiчного матерiалу або з органiв загибло© тварини; - при
вiдсутностi капсул, але наявностi iнших характерних морфологiчних i
культуральних властивостей, чутливостi до сибiркового фагу i пенiцилiну.
2.9. Термiни дослiдження: - мiкроскопiчного - у день надходження матерiалу;
- бактерiологiчного - до 3 дiб; - бiологiчного - до 10 дiб.
3. ВИЯВЛЕННЯ ЗБУДНИКА СИБIРКИ В СИРОВИНI ТВАРИННОГО ПОХОДЖЕННЯ ТА ОБ'╙КТАХ ДОВКIЛЛЯ
3.1. Дослiдження об'╨ктiв довкiлля i сировини тваринного походження проводять:
- при необхiдностi встановити або пiдтвердити джерело або фактор передачi
iнфекцi©;
- для виявлення обсiменiння збудником сибiрки окремих об'╨ктiв;
- з метою виявлення збудника сибiрки в мiсцях старих скотомогильникiв при
проведеннi будiвельних, мелiоративних, гiдротехнiчних та iнших робiт,
пов'язаних з вибиранням i перемiщенням грунту;
- для пiдтвердження результатiв дослiдження шкурок смушку, козеняти та iн. у випадках позитивно©
реакцi© преципiтацi©.
- проведення внутрiшнього лабораторного бактерiологiчного контролю
- змиви з лабораторного обладнання, iнструментарiю, вiдбiр проб повiтря в
лабораторiях, де проводять дослiдження на сибiрку, змивiв та iн.
3.2. Взяття матерiалу на дослiдження
3.2.1. Вiдбiр проб вовни. Для бактерiологiчного дослiдження беруть iз рiзних
мiсць не менше 5 зразкiв масою бiля 2 г кожний (краще брати пучок забруднено©
вовни). Якщо вовна упакована в паки, беруть не менше 10 зразкiв з рiзних
мiсць кожно© паки, а також пил, що зiбрався всерединi обшивки. Зразки вiд
однi╨© паки об'╨днують i упаковують разом.
3.2.2. Вiдбiр проб шкiряно-хутряно© сировини. Для дослiдження беруть шматочки
розмiром 3 х 3 см з периферичних незагнилих i незацвiлих шкурок поруч з
мiсцями, звiдки брали проби для контрольного дослiдження. При наявностi на
внутрiшнiй сторонi шкурки синцiв або iнфiльтратiв проби беруть i в цих мiсцях.
3.2.3. Вiдбiр проб кормiв. Концентрованi корми (зерно, висiвки, комбiкорм)
вiдбирають в залежностi вiд умов ©х зберiгання. При наявностi незатарених
кормiв проби вiдбирають з розрахунку 1 проба масою не менше 100 г на 4 кв. м
поверхнi, але не менше 5 проб вiд кожного засiку, партi©. Проби беруть як з
поверхневих, так i з глибоких шарiв кормiв рiвномiрно по всiй площi.
При наявностi затарених кормiв вiдбiр проводять вiдповiдно до тако© таблицi:
------------------------------------------------------------------ | Кiлькiсть пакувальних одиниць| Вiд яко© кiлькостi пакувальних | одиниць вiдбирають проби | -----------------------------+----------------------------------|
|До 10 |вiд кожно© пакувально© одиницi | -----------------------------+----------------------------------|
|Вiд 11 до 100 |вiд 10 пакувальних одиниць | -----------------------------+----------------------------------|
|Вiд 101 i бiльше |Вiд 10 пакувальних одиниць i | додатково по 3 вiд кожних 100 | пакувальних одиниць | ------------------------------------------------------------------
Вiдбiр проб проводять сухим стерильним щупом. Пiсля взяття проб вiд кожного
об'╨кта (партi©) щуп очищають i обпалюють вогнем паяльно© лампи. Проби грубих
кормiв (сiно, солома) беруть iз рiзних мiсць скирти (стогу) за допомогою
ножиць i пiнцета з розрахунку 1 проба масою не менше 40 г на 4 кв. м площi
скирти. Зiбрану зелену масу беруть, як i грубi корми, збiльшивши масу проби
до 100 г. Коренеплоди (бульбоплоди) вiдбирають з розрахунку 1-3 штуки на 4 кв.
м площi бурту, вiдсiку. З вiдiбраних коренеплодiв скальпелем у мiсцях, де ╨
залишки землi, зрiзають поверхневий шар, який використовують для дослiдження.
Проби силосу, що зберiга╨ться в ямах (траншеях), вiдбирають як проби грунту, а
вийнятого з траншей - як проби зелено© маси. В лабораторiю направляють
середню пробу, яку складають з добре перемiшаних проб дано© партi©, об'╨му i т.п.
Маса середньо© проби не повинна перевищувати 500 г. 3.2.4. Вiдбiр патологiчного
матерiалу вiд тварин На дослiдження направляють вухо, перев'язане в основi
або мазки кровi, отриманi з надрiзу вуха; вiд трупiв свиней - шматки набрякло©
сполучно© тканини i заглоточнi пiдщелепнi, а також iншi лiмфатичнi вузли,
в яких ╨ характернi патолого-анатомiчнi змiни. Вухо вiдрiзають iз тi╨© сторони,
на якiй лежить труп. Попередньо його туго перев'язують шпагатом в основi в двох
мiсцях i вiдрiзають мiж перев'язками. Мiсце вiдрiзу вуха на трупi припiкають.
Якщо пiдозра на сибiрку виникла при розтинi трупа тварини (крiм трупiв свиней),
розтин припиняють i на дослiдження направляють частину селезiнки. Вiдбiр
матерiалу вiд вимушено забитих тварин i його дослiдження проводять вiдповiдно
до ДОСТ 21237-75 "М'ясо. Методи бактерiологiчного аналiзу" i дiючими Правилами
ветеринарного огляду забiйних тварин i ветеринарно-санiтарно© експертизи м'яса
i м'ясних продуктiв ( z0524-02 ). 3.2.5. Вiдбiр проб грунту Обстеженню
пiдлягають дiлянки, що пiдозрюються на зараження збудником сибiрки. Площу, що
дослiджу╨ться, розбивають на квадратнi дiлянки зi стороною не бiльше 4 м.
Грунтовим буром вiдбирають проби грунту масою 20-30 г кожна, по кутах i в
центрi кожно© дiлянки. Проби грунту з територi©, пiдозрювано© в поверхневому
обсiменiннi збудником сибiрки, беруть на глибину до 15 см. Перед взяттям проб
на територi© скотомогильникiв верхнiй шар грунту на мiсцi взяття проби
знiмають на 2-3 см i пробу беруть на глибинi до двох метрiв через кожнi 25 см.
Вийнятий з глибини i не використаний для проб грунт з метою знезараження змiшують
з сухим хлорним вапном, що мiстить 25% активного хлору в спiввiдношеннi 1
частина хлорного вапна на 3 частини грунту, злегка зволожують i скидають у
шурф. Мiсце вiдбору проб дезiнфiкують розчином хлорного вапна, iнструменти
- вогнем паяльно© лампи. 3.2.6. Вiдбiр проб води Проби води з природних i
штучних водоймищ беруть з поверхнi (на глибинi 10-15 см) i бiля дна за
допомогою батометра або спецiально пристосованого бутлю. Об'╨м кожно© проби
не менше 0,5 л, загальний об'╨м не менше 1 л. Крiм того, беруть проби
придонного осаду бiля берега i дослiджують ©х як проби грунту.
3.2.7. Змиви з об'╨ктiв довкiлля роблять з площi 100 кв. см марлевим
тампоном, змоченим стерильною водою. Тампони вмiщують в пробiрки з 4-5 мл
стерильно© води або 0,9%-ного розчину натрiю хлориду i закривають гумовим
корком. Кожну вiдiбрану пробу вмiщують в суху стерильну скляну банку i
закривають стерильною кришкою, корком або пергаментом, можна використовувати
полiетиленовi мiшечки, якi зав'язують шпагатом. Проби води наливають в
стерильнi склянi пляшки i закривають стерильними гумовими корком.
Проби нумерують (проби вовни - номером паки), упаковують у вологонепроникливу
тару i направляють в лабораторiю з посильним. В направленнi до проб вказують
мету проведення дослiдження, найменування матерiалу, його кiлькiсть, мiсце i
дату вiдбору матерiалу. Для проб вовни i кормiв додатково вказують ©х
походження, об'╨м (масу) партi©, вид упаковки i кiлькiсть пакувальних одиниць.
При направленнi до лабораторi© кiлькох проб до супровiдно© прикладають опис,
де вказують номери проб i мiсце вiдбору кожно© проби.
3.2.8. Вiдбiр i упаковку
проб проводять з дотриманням правил особисто© гiгi╨ни i загальноприйнятих в
бактерiологiчнiй практицi правил стерильного вiдбору матерiалу, не допускаючи
розсiювання збудника як при вiдборi, так i транспортуваннi проб.
3.3. Пiдготовка проб до дослiдження
3.3.1. При пiдготовцi проб до дослiдження i подальшо© обробки використовують
тiльки стерильнi розчини, посуд, фiльтри, iнструменти.
3.3.2. Вiд кожно© проби вовни вiдбирають найбiльш забрудненi частини,
подрiбнюють ножицями, разом iз пилом вмiщують в колбу i заливають 10-кратною
(по масi) кiлькiстю 0,9%-ного розчину натрiю хлориду. Колбу закривають,
ретельно струшують протягом 10-15 хв. i дають вiдстоятися. Змив фiльтрують
через 2-3 шари марлi для видалення грубих часток. 3.3.3. З рiзних мiсць прoб
шкурок беруть шматочки масою 1 г, вмiщують в порцелянову ступку i заливають
0,9%-ним розчином натрiю хлориду з таким розрахунком, щоб отримати 10-15 мл
суспензi©. Через деякий час (пiсля достатнього розм'якшення матерiалу)
шматочки подрiбнюють ножицями i залишають при температурi 20 град. С ще на
2-3 год. Пiсля цього проби добре розтирають в тiй же рiдинi до отримання
волокнисто© мезги; мезгу видаляють, попередньо вiджавши ©© товкачем на
внутрiшнiй бiчнiй поверхнi ступки. 3.3.4. Пробу кормiв в кiлькостi 50-100 г
(грубi корми пiсля подрiбнення ножицями) вмiщують в колбу i заливають
0,9%-ним розчином натрiю хлориду з розрахунку отримання 15-20 мл змиву.
Колбу закривають, ретельно струшують протягом 10-15 хв., дають вiдстоятися
5-8 хв., не допускаючи набухання кормiв, i фiльтрують через 2-3 шари марлi.
3.3.5. Проби грунту звiльняють вiд коренiв, камiнчикiв i ретельно перемiшують.
Вiд кожно© проби беруть 50-70 г вмiщують в колбу, заливають 0,9%-ним розчином
натрiю хлориду, дистильованою водою або 0,5%-ним розчином пiрофосфату натрiю з
розрахунку отримання 15-20 мл змиву, добре струшують протягом 25 хв., дають
вiдстоятися 5-8 хв. i фiльтрують через 2-3 шари марлi. 3.3.6. Воду з мулистими
частинками фiльтрують через 2-3 шари марлi, чисту воду дослiджують без
попередньо© пiдготовки.
3.3.7. Тампони, якими роблять змиви з об'╨ктiв
довкiлля, вiджимають об стiнки пробiрки i видаляють, а залишену рiдину дослiджують.
3.4. Методи збагачення i бактерiологiчне дослiдження
3.4.1. Змиви з вовни, кормiв, грунту, пiдготовленi як вказано вище, а також
проби води i змиви з об'╨ктiв довкiлля дiлять на двi частини.
3.4.2. Одну частину прогрiвають на водянiй банi 80 хв. при 65 град.
С i фiльтрують через 1-2 мембраннi фiльтри N 3 у фiльтрi Зейтца при невеликому
вакуумi. Осад з кожного фiльтру змивають 6-8 краплями 0,9%-ного розчину натрiю
хлориду i використовують для посiву. Мембраннi фiльтри перед використанням
стерилiзують кип'ятiнням в дистильованiй водi два рази по 10 хв. зi змiною
води, фiльтр Зейтца - звичайним способом. 3.4.3. Другу частину змиву або проби
без попереднього прогрiвання фiльтрують через мембраннi фiльтри i дослiджують
аналогiчно прогрiтiй частинi проби. Крiм того, змивом з мембрани заражують
двох бiлих мишей пiдшкiрно в дозi 0,2-0,3 мл i спостерiгають за ними 10 дiб.
З органiв загиблих мишей роблять мазки, якi фарбують по Граму i на капсулу,
i посiви на МПА та МПБ.
3.4.4. Змиви з борошнистих кормiв, якi важко фiльтруються через мембраннi
фiльтри, центрифугують 15 хв. при 3000 об/хв. Висiви роблять з поверхневого
шару надосадово© рiдини i осаду. 3.4.5. При вiдсутностi мембранних фiльтрiв
прогрiтi i непрогрiтi змиви, а також проби води центрифугують 15 хв. при 3000
об/хв., надосадову рiдину видаляють, а з осаду роблять висiв.
3.4.6. Суспензi╨ю з шкурок (п. 3.3.4.) заражають двох бiлих мишей, як вказано в п.
3.4.3. Залишок суспензi© центрифугують 15 хв. при 3000 об/хв., потiм 2/3
надосадово© рiдини видаляють, рiдину що залишилася з осадом прогрiвають на
водянiй банi 30 хв. при 65 град. С. Пiсля охолоджування осад використовують
для посiву.
3.4.7. Матерiал, пiдготовлений для дослiдження, висiвають на 3-4 чашки
Петрi з МПА або агаром Хотiнгера i, при наявностi, на диференцiйно-дiагностичне
середовище з 0,01% фенолфтале©нфосфатом натрiю. Засiянi чашки iнкубують в
термостатi при температурi (37 +- 1) град. С протягом 18-24 годин. 3.4.8.
Для iдентифiкацi© з агару вiдбирають не менше 10 шорсткуватих колонiй (при
вiдсутностi тако© кiлькостi - усi шорсткуватi колонi©), якi не змiнили кольору
пiсля обробки парами амiаку.
3.4.9. З вiдiбраних колонiй роблять пересiв на МПА i МПБ для подальшо©
iдентифiкацi© (п.2.8), замiсть МПА пересiв можна робити в систему для
постановки диск-преципiтацi©.
3.5. Постановка та облiк реакцi© диск-преципiтацi©
3.5.1. Посiв роблять у рiдке поживне середовище системи, не торкаючись гелю,
iз кожно© колонi© окремо або висiвають суспензiю, приготовлену з кiлькох
(5-10) колонiй. Посiви витримують в термостатi при (37 +-1) град.
С 16-20 годин. 3.5.2. Облiк результатiв проводять вiзуально через 16-20 год.
iнкубацi© посiвiв в термостатi i при негативному результатi - повторно через
3-4 год. додатково© iнкубацi©.
3.5.З. Пробiрки витягують iз термостату i залишають на 10-15 хв.
при температурi (20 +- 2) град. С. Переглядають в прохiдному свiтлi на
чорному фонi. 3.5.4. Збудник сибiрки утворю╨ в середнiй частинi стовпчика
агарового гелю тонку з чiткою межею бiлу лiнiю (диск) преципiтацi©, яка
зберiга╨ться протягом 4 днiв. 3.5.5. Грунтовi сапрофiтнi бацили, за винятком
деяких штамiв Bacillus, дають негативний результат (диск преципiтацi©
вiдсутнiй). Окремi штами Bacillus через 16-20 годин утворять в нижнiй частинi
агарового стовпчика на межi з преципiтуючою сироваткою рихлу зону преципiтацi©,
яка не ма╨ чiтких меж i значно товща, нiж диск преципiтацi©, що утворю╨ться
збудником сибiрки. Через 36-40 годин зона преципiтацi©, утворена штамами
Bacillus, розпушу╨ться i злива╨ться з преципiтуючою сироваткою.
3.5.6. Як контроль, при постановцi реакцi© диск преципiтацi© можна
використовувати посiви з вакциною СТI.
3.5.7. Культури, що дали позитивнi результати по реакцi© диск-преципiтацi©
або нечiткi результати (рихле кiльце), iдентифiкують як зазначено в п. 2.7.
Культури, що дали негативний результат, подальшому дослiдженню не пiдлягають.
3.6. Отриманi чистi культури iдентифiкують по тестам, визначеним в п.2.9 3.7.
Методи виявлення капсулоутворення
3.7.1.Метод виявлення капсулоутворення in vitro. Дослiджувану культуру
висiвають в середовище ГКI (додаток 2). Пробiрки з посiвами закривають
стерильними гумовими корками i вмiщують в термостат при (37 +-1) град. С.
Через 30-120 хв. iнкубацi© в окремих сибiркових клiтинах почина╨ться
капсулоутворення, а через 16-18 годин всi або бiльшiсть сибiркових клiтин
утворюють капсулу. Для виявлення капсулоутворення з посiвiв роблять мазки
. Мазки фiксують, фарбують на капсулу i вивчають пiд мiкроскопом.
При позитивному результатi в мазках виявляють палички та ланцюжки паличок,
оточених капсулою. 3.7.2. Методи виявлення капсулоутворення in vivo
(прискорена бiологiчна проба). Дослiджувану культуру в дозi 0,1-0,2 мл
вводять внутрiшньочеревно чотирьом бiлим мишам. Через 1-2 год. пiсля
зараження забивають по однiй мишi, розтинають, iз перитонеального ексудату
i органiв роблять мазки-вiдбитки для дослiдження на наявнiсть капсульних
паличок збудника сибiрки. Двох бiлих мишей лишають пiд наглядом до природно©
смертi або на 10 днiв, як при класичнiй бiологiчнiй пробi.
3.8. Визначення вiрулентностi культур збудника сибiрки Визначення
вiрулентностi проводять на кролях масою 2-2,5 кг.
3.8.1. Для зараження готують спорову культуру дослiджуваного штаму.
Для цього добову бульйонну культуру висiвають на одне з таких середовищ:
МПА, агар Хотiнгера, голодний пшеничний або гороховий агар. Посiви витримують
3-4 днi в термостатi при (37 +-1) град. С. Процес спороутворення контролюють
шляхом пiдрахунку спор при мiкроскопi© роздавлено© краплi або пофарбованих
мазкiв. 3.8.2. Пiсля утворення спор у 90-100% мiкробiв бактерiальну масу
змивають фiзiологiчним розчином i визначають концентрацiю спор по стандарту
каламутностi або шляхом посiву серiйних розведень на МПА. З суспензi© спор
вiдомо© концентрацi© готують три робочих розведення з вмiстом 10 тис.,
100 тис. i 1 млн. спор в 1 мл. 3.8.3. Для визначення вiрулентностi двом кролям
вводять пiдшкiрно в дiлянцi живота по 1 мл розведення з концентрацi╨ю 1
млн спор/мл. 3.8.4. Для визначення ступеню вiрулентностi кожним розведенням
(п.3.8.2) у дозi 1 мл заражають пiдшкiрно в дiлянцi живота двох кролiв i
спостерiгають за ними протягом 10 дiб. Ступiнь вiрулентностi Вас. anthracis
визначають по дозi, що викликала смерть кролiв: - високо вiрулентнi штами
викликають смерть кролiв при введеннi 10 тис. спор; - помiрно вiрулентнi - при
введеннi 100 тис. i 1 млн. спор; - слабо вiрулентнi i авiрулентнi штами не
викликають смертi кролiв у зазначених дозах.
4. ПРОТИЕПIДЕМIЧНИЙ РЕЖИМ РОБОТИ
При проведеннi дослiджень на сибiрку необхiдно суворо додержуватись вимог
протиепiдемiчного режиму роботи з матерiалом, зараженим або пiдозрiлим на
зараженiсть збудниками iнфекцiйних захворювань I-II групи патогенностi,
вiдповiдно до вимог Державних санiтарних правил 9.9.5.03599 "Безпека роботи
з мiкроорганiзмами I-II груп патогенностi". Видiленi культури Вас. anthracis
установи охорони здоров'я направляють в лабораторiю особливо небезпечних
iнфекцiй Центрально© санепiдстанцi© МОЗ Укра©ни (референс лабораторiя з
зооантропонозних iнфекцiй), якiй надане право давати остаточний висновок про
належнiсть штамiв до виду Вас. anthracis, при цьому характер i обсяг
протиепiдемiчних i протиепiзоотичних заходiв, до отримання висновкiв
лабораторi©, проводиться вiдповiдно до дiючих нормативних документiв.
5. ВИДIЛЕННЯ ЗБУДНИКА СИБIРКИ З АТИПОВИМ КАПСУЛО-УТВОРЕННЯМ ТА ВIРУЛЕНТНIСТЮ
Методика видiлення атипових по капсулоутворенню i вiрулентностi штамiв
збудника сибiрки розроблена НДПЧI Кавказу та Закавказзя (Б.I.╙ременко,
Н.П.Буравцева) i передбача╨ використання сухого селективного
диференцiально-дiагностичного середовища та содового агару в атмосферi
з пiдвищеним вмiстом вуглекислого газу. Типовi вiрулентнi штами сибiрки
(I тип по класифiкацi© Торна, 1960 р.) в атмосферi з пiдвищеним вмiстом
вуглекислого газу на поверхнi содового агару утворюють гладкi слизовi
блискучi колонi© в S-формi. Цi штами вiрулентнi для бiлих мишей, морських
свинок i кролiв. Крiм таких штамiв, ╨ штами, що вiдносяться до атипових
по капсулоутворенню i вiрулентностi. Штами II типу (вони рiдко зустрiчаються)
утворюють капсулу незалежно вiд наявностi СО2 в атмосферi i ростуть в S-формi,
як на звичайних поживних середовищах, так i на содовому агарi. Цi штами мають
знижену вiрулентнiсть i не викликають гибелi кролiв (для бiлих мишей i
морських свинок вiрулентнi). Штами III типу не утворюють капсулу, авiрулентнi
для експериментальних тварин, на поживних середовищах формують шорсткi матовi
сухi колонi© в R-формi (такi колонi© утворюють типовi вiрулентнi штами сибiрки
I типу на звичайних поживних середовищах - МПА). Атиповi штами являють значний
iнтерес при вивченнi епiдемiологi© та епiзоотологi© сибiрки, мiкробiологi© та
екологi© збудника. Виготовлення селективного диференцiально-дiагностичного
середовища. Наважку сухого середовища для видiлення та культивування сибiрки
(вказана на етикетцi) розплавляють, помiшуючи в 1 л дистильовано© води на
водянiй банi, фiльтрують через ватно-марлевий фiльтр, розливають по пляшках
i стерилiзують в автоклавi при 121 град. С 30 хв. В охолоджене до 45-50 град.
С середовище додають розчин фенолфтале©нфосфату натрiю, який попередньо
прогрiвають при 65 град. С 20 хв., в кiнцевiй концентрацi© 0,01%. Пiсля
перемiщування середовище розливають в чашки Петрi i пiдсушують на протязi
1,5-2 годин при вiдкритих кришках. Виготовлення 1% содового агару.
До розплавленого i охолодженого до 45-50 град. С агару Хотiнгера додають
100 мл 10% розчину двовуглекисло© соди (10 г соди в 100 мл дистильовано© води).
Об'╨м агару доводять до 1 л i розливають в чашки Петрi. Содовий агар готують
перед використанням i не зберiгають. Посiв матерiалу на селективне
диференцiйно-дiагностичне середовище. Дослiджуваний матерiал в
об'╨мi 0,1-0,2 мл наноситься на поверхню середовища, розлитого в чашки
Петрi, ретельно розтирають i переносять шпателем на другу чашку, бажано
використовувати не менше 3-х чашок. Посiви iнкубують в термостатi при
температурi 37 град. С на протязi 16-18 годин. Бiльша частина сапрофiтно©
мiкрофлори на селективному поживному середовищi не росте. Можливе формування
колонiй деяких актиномiцетiв i грибiв, якi легко диференцiюються вiд штамiв
сибiрки, а також колонiй восковидно© бацили. Для диференцiацi© останнiх вiд
збудника сибiрки в чисту чашку Петрi з фiльтрувальним папером наливають 1-2 мл
25% водного розчину амiаку. Чашки вiдкривають, на декiлька секунд вносять
в кришку з амiаком, i знову закривають попередньою кришкою. Колонi©
восковидно© бацили активно ферментують лужну фосфотазу i набувають рожевого
або червоного кольору, а колонi© сибiрки залишаються не зафарбованими.
З усiх не зафарбованих колонiй, як шорстких, сухих, так i гладких слизуватих
роблять мазки i фарбують капсульно-соматичною люмiнесцентною сироваткою.
Для подальшого дослiдження вiдбирають колонi©, в мазках з яких виявляютьс
я палички iз специфiчним свiтiнням (з капсулою, або без не©). Первинна
iдентифiкацiя збудника сибiрки З вiдiбраних колонiй роблять висiви в пробiрки
з бульйоном Хотiнгера i на чашки з содовим агаром. Останнi вмiщують в
анаеростат, в якому замiщають 50% повiтря вуглекислим газом. При вiдсутностi
анаеростату можна використовувати ексикатор з притертою кришкою. На дно
ексикатора (на кожний лiтр об'╨му) насипають 0,4 г двувуглекисло© соди i
додають 0.35 мл концентровано© соляно© кислоти. Пiсля внесення чашок Петрi
з посiвами, ексикатор закривають кришкою i злегка нахиляють, для з'╨днання
соди з кислотою. Облiк результатiв проводять через 24 години iнкубацi© при
температурi 37 град. С. На бульйонi Хотiнгера вiдмiча╨ться придонний рiст
у виглядi жмутика вати, над ним середовище прозоре (рiст характерний для
штамiв I та III типу). Штами збудника сибiрки II типу викликають дифузне
помутнiння середовища. На содовому агарi штами I i II типiв ростуть в S-формi.
З колонiй роблять мазки, фарбують ©х одним iз методiв для виявлення капсули
. В мазках виявляють клiтини оточенi капсулою. Штами III типу ростуть на цьому
середовищi в R-формi, капсула в мазках не виявля╨ться . З культур, що виросли
на содовому агарi готують завись мiкробiв в фiзiологiчному розчинi, якою
заражають бiлих мишей пiдшкiрно по 0,5 мл. Бiопробних тварин, що загинули
або залишилися живими пiсля строку нагляду, розтинають i роблять мазки-вiдбитк
и з внутрiшнiх органiв i мiсця введення культури. В мазках-вiдбитках вiд
загиблих мишей, пiсля зараження штамами I-II типу виявляються капсульн
i клiтини збудника сибiрки. В мазках вiд мишей, що були зараженi штамами Ш
типу мiкробнi клiтини спостерiгаються рiдко, в основному в мiсцях введення
культури, капсули вони не мають.. На 2-3 добу, в мiсцi введення культур
сибiрки всiх типiв, у заражених тварин розвива╨ться специфiчний драглевий
геморагiчний набряк. Бульйоннi культури всiх типiв використовують для
постановки тестiв з сибiрковим бактерiофагом i "перлинового намиста".
Остаточна iдентифiкацiя i визначення вiрулентностi видiлених штамiв
проводиться згiдно з пунктом 2.8. Сукупнiсть ознак штамiв сибiрки, атипових
по капсулоутворенню i вiрулентностi узагальненi в таблицi.
Бiологiчнi властивостi атипових штамiв збудника сибiрки
----------------------------------------------------------------------
| Ознака | Тип | штаму | -----------------------------+-----------------+--------------------| | II | III | -----------------------------+-----------------+--------------------|
|Морфологiчна форма | колонiй: | А) на селективному середовищi| S | R, RO, O | або агарi Хотiнгера при | вирощуванi в повiтрянiй | атмосферi | Б) на 1 % содовому агарi в | S | R | атмосферi з 50% СО2 | -----------------------------+-----------------+--------------------|
|Рiст на бульйонi Хотiнгера | Дифузний мутний |Придонний, середови-| | ще над осадом | прозоре або злегка | опалесцююче | -----------------------------+-----------------+--------------------|
|Капсулоутворення: | А) на селективному середовищi| + | або агарi Хотiнгера при | вирощуваннi в повiтрянiй | атмосферi | Б) на 1% содовому агарi в | + | атмосферi з 50% СО2 | В) в органiзмi тварини | + | -----------------------------+-----------------+--------------------|
|Вiрулентнiсть: | смерть на 1-5 добу в| |- для бiлих мишей |Смерть на 1-5добу|дозах бiльше 10^5 | спор | - для морських свинок | -""- |можлива смерть | поодиноких 0000тварин | вiд доз бiльше 10^5 | не виклика╨ |спор | - для кролiв |смертi |не виклика╨ смертi | ----------------------------------------------------------------------
В розробцi iнструкцi© приймали участь: вiд Мiнiстерства охорони здоров'я:
Л.М.Мухарська, А.Г.Падченко, Е.А.Лауген;
вiд Iнституту епiдемiологi© та iнфекцiйних хвороб iм. Л.В.Громашевського АМН:
Е.О.Шабловська, Н.М.Кролевецька, В.I.Кiкоть;
вiд Центрально© санепiдстанцi© МОЗ Укра©ни:
Л.С.Некрасова, В.М.Свита, Л.В.Третьякова, I.М.Капiтанова, Н.Б.Видайко, I.В.Присяжнюк;
вiд Кримсько© республiкансько© санепiдстанцi©: Л.М.Альянакi;
вiд обласних санепiдстанцiй:
Донецько© Е.В.Смирнова;
Львiвсько© М.С.Нефедова.
Додаток 1 до Iнструкцi© з лабораторно© дiагностики сибiрки у людей, в
сировинi тваринного походження та об'╨ктах довкiлля Порядок iнформування
про видiлення культур збудникiв сибiрки Iнформацiя про видiлення культури
вiд людей та з об'╨ктiв довкiлля пода╨ться до Центрально©
санiтарно-епiдемiологiчно© станцi© МОЗ Укра©ни телефоном (416-1522),
телефоном-факсом (417-3775) або електронною поштою, не пiзнiше 12 годин
пiсля видiлення. Номер штаму _________________________________________________
Вид штаму ___________________________________________________
Дата та мiсце видiлення _____________________________________
Об'╨кт дослiдження __________________________________________
Прiзвище, iм'я, по батьковi, вiк хворого ____________________
_____________________________________________________________
Дата направлення матерiалу на дослiдження ___________________
Дiагноз при видiленнi культури вiд людей ____________________
_____________________________________________________________
Основнi властивостi штаму ___________________________________
_____________________________________________________________
Пiдпис __________________
Про затвердження iнструкцi© з лабораторно© дiагностики сибiрки у людей, в сировинi тваринного походження та об'╨ктах довкiлля
...продовження...
Додаток 2
до Iнструкцi© з лабораторно©
дiагностики сибiрки у
людей, в сировинi тваринного
походження та об'╨ктах
довкiлля
Метод фiксацi© мазкiв в етиловому спиртi з додаванням 3%
перекису водню
При даному методi фiксацi© мазкiв споровi i вегетативнi форми
Вас. anthracis знезаражуються через 30 хв., при цьому не
порушу╨ться морфологiя мiкроба i специфiчнiсть свiчення при
фарбуваннi люмiнiсцентними сироватками.
Для приготування фiксуючо© рiдини у флакон наливають 180 мл
етилового спирту 96 % i 20 мл З0%-ного пергiдролю. Вмiст перекису
водню в пергiдролi, при необхiдностi, визначають за методикою,
викладеною в Державнiй фармакопе©.
Фiксуючу рiдину можна використовувати протягом мiсяця, флакон
закривають притертим корком i зберiгають в темному мiсцi.
Мазки готують на чистих знежирених скельцях загальноприйнятим
методом, висушують на повiтрi i занурюють в посуд з фiксуючою
рiдиною. Через 30 хв. мазки витягують i висушують на повiтрi.
Витримувати мазки бiльш 30 хв. в фiксуючiй рiдинi небажано.
Подальшi манiпуляцi© з мазками проводять як iз знезараженим
матерiалом.
Методи фарбування капсул
Фарбування по Ребiгеру. Мазок на протязi 15-20 секунд
фарбують формалiнiзованим генцiанвiолетом, фарбу швидко змивають
водою, висушують i мiкроскопують.
Бактерi© сибiрки - темно-фiолетовi, касули -
червоно-фiолетовi.
Фарбування по Бурцеву. Мазок на протязi 5 хвилин фарбують
фуксином Циля, розведеним 1:1 дистильованою водою, промивають
водою, ополiскують 60 % спиртом, пiдкисленим оцтовою кислотою,
промивають водою, висушують. Бактерi© червонi, капсули - рожевi.
Фарбування по Мiхiну. Мазок на протязi 3- 5 хвилин фарбують
розчином синьки Льофлера, швидко промивають невеликою кiлькiстю
води, висушують. Бактерi© темно синi, капсули - рожевi.
Фарбування по Ольту. Мазок на протязi 1-3 хвилин фарбують
2-3% водним розчином сафранiну, виготовленим безпосередньо перед
вживанням (сафранiн розчиняють в гарячiй водi i фiльтрують при
пiдiгрiваннi), промивають водою та висушують. Бактерi©
коричневi, капсули - блiдо жовтi. Капсули бiльш чiтко видно при
переглядi мазку у краплi води.
Фарбування по Романовському - Гiмзi. Мазок на протязi 15-20
хвилин фарбують розчином фарби Романовського-Гiмзи (2-3 краплi
фарби на 1 мл нейтрально© дистильовано© води). Препарат вмiщують в
чашку Петрi мазком вниз i заливають приготовленою фарбою,
промивають водою i висушують. Бактерi© темно-синi, капсули -
рожевi.
Метод фарбування спор по Пешкову
На фiксований мазок наливають синьку Льофлера, пiдогрiвають
до кипiння над полум'ям пальника на протязi 15-20 секунд. Пiсля
охолодження мазок промивають водою i дофарбовують 0,5% водним
розчином нейтральроту на протязi 30-60 секунд. Промивають водою,
висушують i мiкроскопують. Спори - синього кольору, молодi спори
можуть зафарбовуватись в чорно-синiй колiр, протоплазма в рожевий.
Диференцiйно-дiагностичне середовище для видiлення Вас.
anthracis
Для диференцiацi© колонiй збудника сибiрки вiд колонiй
спороутворюючих сапрофiтiв використовують тест виявлення лужно©
фосфатази.
Первиннi посiви або пересiви пiдозрiлих культур на
диференцiйно-дiагностичному середовищi iнкубують в термостатi при
(3 +-1) град. С протягом 18-24 годин.
При наявностi росту мiкроорганiзмiв в кришку чашки Петрi
вносять 1-2 мл 25 %-ного водного розчину амiаку. Чашку (кришкою
вниз) витримують при (20 +-2) град. С протягом 1 хв., пiсля чого
вiзуально або пiд малим збiльшенням мiкроскопа проводять облiк
тесту.
Пiд дi╨ю парiв амiаку колонi© мiкроорганiзмiв, яким властива
фосфатазна активнiсть, стають рожевими.
Вас. anthracis фосфатазна активнiсть не властива i його
колонi© залишаються безбарвними.
Приготування розчинiв iнгредi╨нтiв.
Полiмiксин М сульфат розчиняють у флаконi в стерильнiй
дистильованiй водi i послiдовними розведеннями стерильним 0,9%-ним
розчином натрiю хлориду доводять до концентрацi©0 од/мл.
Невiграмон переносять у скляний флакон або пробiрку i
розчиняють у 25%-ному водяному розчинi амiаку при ретельному
перемiшуваннi скляною паличкою. Далi послiдовно розводять
стерильним 0,9%-ним розчином натрiю хлориду до концентрацi© 100
мкг/мл.
Миючий засiб "Прогрес" або "Лотос" розводять стерильною
дистильованою водою до 0,1%-но© концентрацi©.
Гризеофульвiн в таблетках ретельно розтирають у ступцi,
розчиняють в стерильнiй дистильованiй водi до вмiсту 100 мкг
препарату в 1 мл.
Фенолфтале©нфосфат натрiю (комерцiйний 10%-ний розчин) для
стерилiзацi© прогрiвають на водянiй банi при 56 град. С 30 хв.
Приготування диференцiйно-дiагностичного середовища.
Поживний агар в колбах по 100 мл розплавляють в киплячiй
водянiй банi i охолоджують до температури 45-50 град. С. В агар
додають основнi розчини:
полiмiксина М сульфату - 0,5 мл
невiграмона - 0,5 мл
грiзеофульвiна - 1,0 мл
миючого засобу "Прогрес" або "Лотос" - 1,0 мл
фенолфтале©нфосфату натрiю - 0,1 мл
Примiтка: гризеофульвiн додають у середовище при пiдозрi на
забруднення матерiалу грибами.
Пiсля перемiшування середовище розливають у чашки Петрi i
пiдсушують протягом 1,5-2 год. з вiдкритими кришками.
Диференцiйно-дiагностичне середовище пiсля розливу зберiгають в
холодильнику протягом 1-2 доби.
Система для постановки реакцi© диск-преципiтацi©
Для постановки реакцi© диск-преципiтацi© необхiдно мати:
- преципiтуючу сибiркову сироватку;
- очищений 1%-ний агаровий гель або 1%-ний агар Дифко;
- рiдке поживне середовище, придатне для культивування
збудника сибiрки.
Приготування системи для постановки реакцi©
диск-преципiтацi©.
Преципiтуючу сибiркову сироватку розливають по 0,5-1 мл у
стерильнi бактерiологiчнi пробiрки. На поверхню сироватки, по
стiнцi пробiрки, нашаровують пастерiвською пiпеткою розплавлений i
охолоджений до 45-50 град. С 1%-ний агаровий гель стовпчиком
висотою 5-7 мл. Пробiрки тримати у вертикальному положеннi до
охолодження агару.
На поверхню охолодженого агару наносять 1-1,5 мл рiдкого
поживного середовища. При iдентифiкацi© культур, видiлених з
об'╨ктiв довкiлля i сировини тваринного походження, як рiдке
поживне середовище, можна використовувати середовище ГКI або
бульйон Хотiнгера з 40% iнактивовано© сироватки кровi (крiм
м'ясо-пептонного бульйону), у цьому випадку одночасно можна
провести дослiдження i на капсулоутворення.
Систему готують i використовують у день постановки реакцi©.
Виготовлення очищеного 1%-ного агарового гелю.
Готують нейтральну дистильовану воду рН-7,0. Для цього
визначають рН дистильовано© води i, в залежностi вiд отриманих
результатiв, ©© нейтралiзують 1%-ним розчином двовуглекисло© соди
(при кислiй реакцi©) або 0,1%-ним розчином соляно© кислоти (при
лужнiй реакцi©).
Необхiдну для нейтралiзацi© кiлькiсть розчину визначають так:
до 100 мл води невеличкими порцiями (мiлiлiтрами або краплями)
додають один iз зазначених розчинiв, постiйно визначаючи рН; при
досягненнi нейтрально© реакцi© (рН-7.0) точно розраховують
кiлькiсть розчину, необхiдного для нейтралiзацi© всього обсягу
дистильовано© води.
5 г агар-агару заливають 300 мл нейтрально© дистильовано©
води i нагрiвають у киплячiй водянiй банi до повного розплавлення
агар-агару.
Одночасно готують водяний розчин бiлку курячого яйця. Беруть
охолоджене яйце масою не менше 56 г i вiдокремлюють бiлок, який
старанно збивають до утворення пiнисто© маси i розчиняють у 200 мл
нейтрально© дистильовано© води. Приготовлений розчин бiлка дiлять
на двi частини по 100 мл.
У розплавлений агар добавляють 0,5 г хлористого кальцiю
(CaCl2 x 6Н2О), перемiшують i охолоджують до 45-50 град. С. До
сумiшi додають 100 мл водного розчину бiлка курячого яйця,
ставлять у киплячу водяну баню i нагрiвають до появи пластiвцiв
коагуляцi© (приблизно 15-20 хв.).
Якщо бiлок не згорта╨ться або коагуляцiя проходить погано,
вносять ще 0,25-0,5 г хлористого кальцiю i продовжують нагрiвати
до появи пластiвцiв коагуляцi©.
Гарячий агар фiльтрують через попередньо змочений у гарячiй
дистильованiй водi i вiджатий ватний фiльтр.
До профiльтрованого агару додають другу частину (100 мл)
водного розчину я╨чного бiлка, перемiшують i знову нагрiвають у
киплячiй водянiй банi до появи пластiвцiв коагуляцi©. У випадку
поганого згортання бiлка, роблять так, як i при внесеннi першо©
порцi© (див. вище).
Пiсля згортання бiлка агар знову фiльтрують у гарячому видi.
Очищений 1%-ний агаровий гель повинен бути прозорим.
Вiдфiльтрований агаровий гель розливають в пробiрки або колби i
стерилiзують автоклавуванням при 0,5 атм протягом 20 хв. Якщо
пiсля автоклавування випада╨ осад, агаровий гель фiльтрують i
стерилiзують повторно.
Готове середовище зберiгають в холодильнику (2-4 град. С) i
використовують протягом 6 мiсяцiв. Для запобiгання висихання
пробiрки з агаровим гелем загортають у полiетиленовий пакет.
Середовище ГКI
Для приготування середовища до розчину Хенкса з бiкарбонатом
натрiю або бульйону Хотiнгера додають 40% стерильно© бичачо©
сироватки кровi, iнактивовано© при 56 град. С протягом 70 хв.
Пiсля змiшування компонентiв рН середовища 5%-ним розчином
бiкарбонату натрiю доводять до 7,2-7,4
Постановка тесту "перлинового намиста"
Перед постановкою тесту готують стерильний МПА i розливають у
три пробiрки по 10 мл (або 3 колби по 100 мл).
У 2 пробiрки (колби) iз розплавленим i охолодженим до 45-50
град. С агаром стерильно вносять пенiцилiн iз розрахунку 0,5 i
0,05 ОД на 1 мл середовища, третя - контрольна.
Одержання необхiдно© концентрацi© пенiцилiну:
-------------------------------------------------------------------
|NN |Кiлькiсть |Кiлькi-|Отримана| Кiлькiсть середовища | пп |розчиненого |сть |концент-|-----------------------------| | пенiцилiну |МПА, |рацiя | 100 мл | 10 мл | що | --------------+--------------| | дода╨- | Внося-|Концен-|Внося-|Концен-| | ться | ть |трацiя |ть |трацiя | (мл) | розчи-|пенiци-|розчи-|пенiци-| | ну |лiну |ну |лiну | пенiци|(од/мл)|пенiци|(од/мл)| | -лiну | -лiну | (мл) | (мл) | ---+--------------+-------+--------+------+-------+------+-------|
| 1 | 100000 од | 10 | 10000 | ---+--------------+-------+--------+------+-------+------+-------|
| 2 |1 мл розв. N 1| 9 | 1000 | ---+--------------+-------+--------+------+-------+------+-------|
| 3 |1 мл розв. N 2| 9 | 100 | 0,5 | 0,5 | ---+--------------+-------+--------+------+-------+------+-------|
| 4 |1 мл розв. N 3| 9 | 10 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | ---+--------------+-------+--------+------+-------+------+-------|
| 5 |1 мл розв. N 4| 9 | 1 | 0,5 | 0,5 | -------------------------------------------------------------------
Додаток 3
до Iнструкцi© з лабораторно©
дiагностики сибiрки у
людей, в сировинi тваринного
походження та об'╨ктах
довкiлля
ДИФЕРЕНЦIАЦIЯ B.ANTHRACIS ТА СПОРIДНЕНИХ СПОРОУТВОРЮЮЧИХ АЕРОБIВ
------------------------------------------------------------------ | Ознака |B.anth-|B. | B. |B.sub- |B.subti- |B.megate-| | racis |cereus | cereus |tilis |lis var. | rium | var. | mesente- | mycoides| | ricus | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Капсулоут- | + | - | - | - | - | - | ворення в | атмостферi | з | пiдвищенним| | вмiстом СО2| | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
| Рухомiсть | - | + | + | + | + | + | (висяча | крапля) | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Гемолiз ЕБ | - | + | + | +- | +- | - | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------| | Рiст на |Середо-|Середо-|Середо- |Бульйон|Бульйон |Помутнiн-| | рiдких |вище |вище |вище |мутний,|залиша╨- |ня | середовищах|прозоре|мутне, |прозоре,|при |ться |середови-|
|на бульйонi|з |осад |на днi |утворе-|прозорим,|ща, без | осадом |крихопо|осад у |ннi |на |плiвки, | (у |дiбний,|виглядi |плiвки |поверхнi |осад | виглядi|не |"жмутка |просвi-|зморщена |незначний| | "жмутка|розбива|вати", |тлю╨ть-|плiвка | вати"),|-╨ться,|не |ся | без |мiцна |розбива-| | плiвки,|плiвка |╨ться, | кiльце |(може |без | навколо|тiльки |плiвки | стiнок |навколо| | легко |стiнок)| | змива╨-| | ться | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
| На молоцi |Пiдкис-|Пепто- |Пептонi-|Пiдлу- |Пептонi- |Пептонi- | лення, |нiзацiя|зацiя; |ження, |зацiя |зацiя | згорта-|швидка,|згортан-|повiль-|повiльна,|вiдсутня,| | ння i |iз |ня |на |iнодi |згортання| | пепто- |згортан|вiдсутн╨|пептонi|згортання|вiдсутн╨ | нiзацiя|ням або| |-зацiя,| | (повi- |без | згорта-| | льна) |нього | ння | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------| | Рiст на |Сiро- |Колонi©|Колонi© |Колонi©|Товстий |Колонi© | твердих |бiлi, |бiлi |у |бiлi |матово- |слизуватi|
|середовищах|як |твердi,|виглядi |або |бiлуватий|жовто- | На агарi |пушинки|круглi,|повстi, |сiрува-|зморшений|дiлi, | колонi©|iнодi |повзучi |тi, |налiт, |темнiють | при |жовту- |по |повзучi|утворю╨ |при | збiль- |ватi, |поверхнi|на |плiвку в |наявностi| | шеннi у|по |середо- |стiнки |конденса-|тирозину | виглядi|краях |вища |пробiр-|тi | "гриви |хвиляс-| |ки, у | лева" |тi | конден-| | нитки | сатi | плiвка | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Лакмусова |Черво- | Синi╨ | Синi╨ | Синi╨ | Синi╨ | - | сироватка | нi╨ | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Ферментацiя| +- | + | + | - | +- | - | згорнутого |(повi- | я╨чного |льно) | середовища | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Арабiнози | - | - | - | + К | + К | +- К | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Ксилози | - | - | - | + К | + К | +- К | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Крохмалю | + | + | + | + | - | + | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Салiцину | +- | + | Даних | Даних | + | Даних | (повi- | нема╨ | нема╨ | нема╨ | льно) | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Вiдновлюва-| - | + | - | +- | - | Даних | ння | нема╨ | метиленово-| | го синього | в | середовищi | (через 48 | год.) | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Утворення | - | +- | +- | - | - | +- | уреази | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Редукцiя | +- | +- | +- | + | - | +- | нiтратiв | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Реакцiя | + | - | +- | + | + | - | Фогес- | Проскауера | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Чутливiсть | + | - | - | - | - | - | до | пенiцилiну | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Патоген | + |Патоген| - | - | - | - | нiсть: | ний при| | Для мишей | в/черев| | -ному | введен-| | нi | великих| | доз | -----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------| | Для | + | - | - | - | - | - | морських | свинок i | кролiв |